Giải thích tại sao trong quá trình độ mẫu phổ cần phải chạy mẫu nền baseline

TRUYỀN NHIỄM VIỆT NAM

✮

SỐ 2(34) - 2021 -

31

nếu không lấy được ở đúng vị trí giải phẫu mà chỉ ngoáy

được phần ngoài khu vực tiền đình mũi cũng sẽ cho kết

quả âm tính giả. Do đó việc đào tạo điều dưỡng viên, kĩ

thuật viên lấy mẫu chuẩn xác là cực kỳ quan trọng.

Thông thường lấy mẫu ngay khi xuất hiện triệu chứng

bệnh, tuy nhiên với những trường hợp nhiễm không triệu

chứng thì thời điểm lấy mẫu rất quan trọng. Lấy quá sớm

(1 - 3 ngày) sau khi phơi nhiễm có thể dẫn tới âm tính giả

do vi rút chưa kịp nhân lên đủ lượng để phát hiện được.

Ngược lại lấy mẫu quá muộn (thường từ ngày bệnh từ 17

trở đi) cũng sẽ cho kết quả âm tính do lúc này cơ thể đã

đào thải hết vi rút

(6)

. Lúc này thì cần làm thêm xét nghiệm

kháng thể IgM - IgG để xác định liệu bệnh nhân đã phơi

nhiễm hay chưa. Lưu ý rằng đối với COVID-19 thì IgM

không phải là marker đặc hiệu cho giai đoạn cấp của

bệnh

(7)

như đối với các tác nhân thông thường khác bởi

nhiều bệnh nhân IgM còn xuất hiện muộn hơn cả IgG.

Giai đoạn đầu của dịch, khi môi trường VTM còn

chưa phổ biến thì nhiều đơn vị dùng nước muối sinh lý

hoặc PBS (phosphat buffer saline) thay thế. Bản thân

nước muối hay PBS không có chất ức chế PCR, tuy nhiên

nếu ống đựng môi trường không đảm bảo, chẳng hạn

dính 1 ít heparin hoặc có bột găng tay bám vào hay bất

kỳ chất ức chế nào sẽ làm PCR không thực hiện được dẫn

tới kết quả âm tính giả. Do đó, khuyến cáo nên mua sẵn

ống môi trường vận chuyển tiêu chuẩn bởi môi trường này

có tác dụng bảo quản vi rút sống để ngoài PCR còn có thể

làm nuôi cấy, phân lập (nước muối hay PBS chỉ có thể

dùng cho PCR do vi rút trong mẫu sẽ chết).

Quá trình trong xét nghiệm

Hiện nay quy định cho phép có

thể gộp đến 10 - 20 mẫu cho 1 phản ứng PCR

(8)

, tuy nhiên

với những người làm PCR kinh nghiệm, gộp từ 5 mẫu trở

xuống sẽ an toàn hơn. Lý do là vì khi gộp mẫu nghĩa là đã

giảm thể tích tách chiết, do đó nguy cơ âm tính giả, bỏ lọt

ca bệnh sẽ cao hơn. Thực tế cho thấy với những mẫu Ct

tầm 33-35 trở lên thì khi gộp sẽ âm tính.

Đối với quy trình tách tay dùng kit (chẳng hạn Qiagen

RNA extraction kit

(9)

.

Hóa chất tách chiết không đảm bảo: đặc biệt là car-

rier RNA do để lâu hoặc bảo quản không đúng cách. Theo

quy định của nhà sản xuất, carrier RNA sau khi hoàn

nguyên, nếu dùng ngay thì cho vào lysis buffer AVL, nếu

không dùng ngay phải chia vào các aliquot nhỏ và cất tủ

-20o, lần sau lấy đủ lượng ra dùng, tránh tan đông nhiều

lần. Nếu làm không đúng thì hiệu suất thu RNA sẽ bị ảnh

hưởng dẫn đến âm tính giả. Do đó, để đảm bảo chất

lượng thì mẫu nên tách cùng chứng nội tại là EAV là một

virus RNA từ hải cẩu (equine). Nếu chứng nội tại cho kết

quả tốt thì có thể tin tưởng hiệu suất tách chiết đảm bảo.

điều này dễ xảy ra do kĩ thuật viên mới

làm, chưa thạo quy trình nên dễ nhầm thứ tự cho các

buffer gồm cồn, AW1. AW2 hoặc rửa lần 2 lẽ ra phải cho

AW2 nhưng lại dùng nhầm lọ AW1. Ngoài ra sai sót còn có

thể gặp khi quên không thêm cồn vào 2 lọ AW1 và AW2.

Thông thường nếu tách ít thì không mấy khi quên nhưng

khi tách chiết nhiều và dùng kit mới liên tục thì dễ gây

nhầm lẫn giữa buffer của kit cũ và kit mới. Để tránh hiện

tượng này thì nên cố gắng dùng hết vật tư của kit cũ mới

chuyển sang kit mới và các buffer cũ còn thừa thì nên bỏ

đi. Trong thực tế các phòng thí nghiệm hay dồn buffer

thừa lại dẫn tới nhầm lẫn lọ cũ lọ mới. Ngoài ra cũng cần

đánh dấu lọ nào đã thêm cồn và ngày mở lọ để người

dùng sau dễ dàng phân biệt.

Đối với tách chiết hệ thống tự động: (chẳng hạn

Magna Pure 96, Magna 24) các hệ thống này thường sử

dụng bi từ thu RNA nên hiệu suất thu hồi RNA phụ thuộc

máy móc và hóa chất hãng, tuy nhiên thường không tốt

bằng tách tay. Do đó khuyến cáo nên tách cùng chứng

nội tại và chạy PCR cùng để đảm bảo chất lượng xét

nghiệm.

tách chiết

xong thì sẽ thêm 5 - 10ul RNA khuôn mẫu vào ống mas-

ter mix để chạy phản ứng PCR. Tuy nhiên nếu chạy nhiều

(làm PCR đĩa) mà lại dùng pipette đơn kênh thì rất dễ bỏ

sót hoặc hút thiếu thể tích gây âm tính giả. Giải pháp cho

tình trạng này là dùng pipette đa kênh nếu mẫu được tách

chiết tự động. Còn nếu mẫu tách tay thì tốt nhất khi tra

mẫu nên có 2 người và hạn chế chạy mẫu đêm bởi khi

KTV mệt, đếm nhầm thì rất dễ dẫn đến sai sót.

Quá trình sau xét nghiệm

Sau khi hoàn tất chương trình PCR, một số máy cho

phép chỉnh baseline (đường nền) theo đó giá trị Ct value

cũng sẽ thay đổi nhất định. Nếu chỉnh baseline quá cao sẽ

khiến một số mẫu đang từ dương tính yếu thành âm tính.