TRUYỀN NHIỄM VIỆT NAM
✮
SỐ 2[34] - 2021 -
31
nếu không lấy được ở đúng vị trí giải phẫu mà chỉ ngoáy
được phần ngoài khu vực tiền đình mũi cũng sẽ cho kết
quả âm tính giả. Do đó việc đào tạo điều dưỡng viên, kĩ
thuật viên lấy mẫu chuẩn xác là cực kỳ quan trọng.
Thông thường lấy mẫu ngay khi xuất hiện triệu chứng
bệnh, tuy nhiên với những trường hợp nhiễm không triệu
chứng thì thời điểm lấy mẫu rất quan trọng. Lấy quá sớm
[1 - 3 ngày] sau khi phơi nhiễm có thể dẫn tới âm tính giả
do vi rút chưa kịp nhân lên đủ lượng để phát hiện được.
Ngược lại lấy mẫu quá muộn [thường từ ngày bệnh từ 17
trở đi] cũng sẽ cho kết quả âm tính do lúc này cơ thể đã
đào thải hết vi rút
[6]
. Lúc này thì cần làm thêm xét nghiệm
kháng thể IgM - IgG để xác định liệu bệnh nhân đã phơi
nhiễm hay chưa. Lưu ý rằng đối với COVID-19 thì IgM
không phải là marker đặc hiệu cho giai đoạn cấp của
bệnh
[7]
như đối với các tác nhân thông thường khác bởi
nhiều bệnh nhân IgM còn xuất hiện muộn hơn cả IgG.
Giai đoạn đầu của dịch, khi môi trường VTM còn
chưa phổ biến thì nhiều đơn vị dùng nước muối sinh lý
hoặc PBS [phosphat buffer saline] thay thế. Bản thân
nước muối hay PBS không có chất ức chế PCR, tuy nhiên
nếu ống đựng môi trường không đảm bảo, chẳng hạn
dính 1 ít heparin hoặc có bột găng tay bám vào hay bất
kỳ chất ức chế nào sẽ làm PCR không thực hiện được dẫn
tới kết quả âm tính giả. Do đó, khuyến cáo nên mua sẵn
ống môi trường vận chuyển tiêu chuẩn bởi môi trường này
có tác dụng bảo quản vi rút sống để ngoài PCR còn có thể
làm nuôi cấy, phân lập [nước muối hay PBS chỉ có thể
dùng cho PCR do vi rút trong mẫu sẽ chết].
Quá trình trong xét nghiệm
Hiện nay quy định cho phép có
thể gộp đến 10 - 20 mẫu cho 1 phản ứng PCR
[8]
, tuy nhiên
với những người làm PCR kinh nghiệm, gộp từ 5 mẫu trở
xuống sẽ an toàn hơn. Lý do là vì khi gộp mẫu nghĩa là đã
giảm thể tích tách chiết, do đó nguy cơ âm tính giả, bỏ lọt
ca bệnh sẽ cao hơn. Thực tế cho thấy với những mẫu Ct
tầm 33-35 trở lên thì khi gộp sẽ âm tính.
Đối với quy trình tách tay dùng kit [chẳng hạn Qiagen
RNA extraction kit
[9]
.
Hóa chất tách chiết không đảm bảo: đặc biệt là car-
rier RNA do để lâu hoặc bảo quản không đúng cách. Theo
quy định của nhà sản xuất, carrier RNA sau khi hoàn
nguyên, nếu dùng ngay thì cho vào lysis buffer AVL, nếu
không dùng ngay phải chia vào các aliquot nhỏ và cất tủ
-20o, lần sau lấy đủ lượng ra dùng, tránh tan đông nhiều
lần. Nếu làm không đúng thì hiệu suất thu RNA sẽ bị ảnh
hưởng dẫn đến âm tính giả. Do đó, để đảm bảo chất
lượng thì mẫu nên tách cùng chứng nội tại là EAV là một
virus RNA từ hải cẩu [equine]. Nếu chứng nội tại cho kết
quả tốt thì có thể tin tưởng hiệu suất tách chiết đảm bảo.
điều này dễ xảy ra do kĩ thuật viên mới
làm, chưa thạo quy trình nên dễ nhầm thứ tự cho các
buffer gồm cồn, AW1. AW2 hoặc rửa lần 2 lẽ ra phải cho
AW2 nhưng lại dùng nhầm lọ AW1. Ngoài ra sai sót còn có
thể gặp khi quên không thêm cồn vào 2 lọ AW1 và AW2.
Thông thường nếu tách ít thì không mấy khi quên nhưng
khi tách chiết nhiều và dùng kit mới liên tục thì dễ gây
nhầm lẫn giữa buffer của kit cũ và kit mới. Để tránh hiện
tượng này thì nên cố gắng dùng hết vật tư của kit cũ mới
chuyển sang kit mới và các buffer cũ còn thừa thì nên bỏ
đi. Trong thực tế các phòng thí nghiệm hay dồn buffer
thừa lại dẫn tới nhầm lẫn lọ cũ lọ mới. Ngoài ra cũng cần
đánh dấu lọ nào đã thêm cồn và ngày mở lọ để người
dùng sau dễ dàng phân biệt.
Đối với tách chiết hệ thống tự động: [chẳng hạn
Magna Pure 96, Magna 24] các hệ thống này thường sử
dụng bi từ thu RNA nên hiệu suất thu hồi RNA phụ thuộc
máy móc và hóa chất hãng, tuy nhiên thường không tốt
bằng tách tay. Do đó khuyến cáo nên tách cùng chứng
nội tại và chạy PCR cùng để đảm bảo chất lượng xét
nghiệm.
tách chiết
xong thì sẽ thêm 5 - 10ul RNA khuôn mẫu vào ống mas-
ter mix để chạy phản ứng PCR. Tuy nhiên nếu chạy nhiều
[làm PCR đĩa] mà lại dùng pipette đơn kênh thì rất dễ bỏ
sót hoặc hút thiếu thể tích gây âm tính giả. Giải pháp cho
tình trạng này là dùng pipette đa kênh nếu mẫu được tách
chiết tự động. Còn nếu mẫu tách tay thì tốt nhất khi tra
mẫu nên có 2 người và hạn chế chạy mẫu đêm bởi khi
KTV mệt, đếm nhầm thì rất dễ dẫn đến sai sót.
Quá trình sau xét nghiệm
Sau khi hoàn tất chương trình PCR, một số máy cho
phép chỉnh baseline [đường nền] theo đó giá trị Ct value
cũng sẽ thay đổi nhất định. Nếu chỉnh baseline quá cao sẽ
khiến một số mẫu đang từ dương tính yếu thành âm tính.