Kỹ thuật PCR [viết tắt của Polymerase chain reaction] là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm ADN và sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một trình tự ADN cụ thể.
Thông qua PCR, một đoạn ADN với lượng rất nhỏ [chỉ vài nanogram] có thể được khuếch đại theo cấp số nhận để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN đó.
PCR hiện là một kỹ thuật cơ bản quan trọng và thường không thể thiếu được trong quy trình nghiên cứu của các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y và xét nghiệm ADN.
PCR được phát minh bởi TS. Kary Mullis vào năm 1983. Vào thời điểm đó, ông đang làm việc tại Cetus Corporation, một trong những công ty công nghệ sinh học đầu tiên. Công trình của Kary Mullis đã vinh dự được nhận giải Nobel về Hóa học vào năm 1993 cùng với Michael Smith.
Nguyên lý kỹ thuật PCR
PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN mới từ chuỗi ADN ban đầu được cung cấp.
Bởi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có từ trước, nên enzyme này cần một đoạn ADN mồi để có thể thêm nucleotide đầu tiên.
Yêu cầu này cho phép phân định một vùng cụ thể của chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại. Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ được tích lũy thành hàng tỷ bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu.
Thành phần của một phản ứng PCR thường bao gồm:
- Dung dịch ADN mẫu [DNA template] chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản.
- Primers: là các đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu.
- DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase.
- Nucleotides [deoxynucleoside triphosphates; dNTPs]: bao gồm 4 loại [A, T, G, C] –> là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của ADN –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao.
- Dung dịch đệm [buffer solution]: cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase
- Ống PCR [PCR tube]: là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR [Thermal cycler]
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm 6 bước chính:
- Initialization: hỗn hợp dung dịch PCR được gia nhiệt lên đến 94–98 °C trong thời gian 1-10 phút để làm nóng
- Denaturation: đoạn trình tự ADN sợi đôi được làm nóng và phân tách thành 2 sợi ADN đơn, tạo khuôn cho quá trình nhân bản
- Annealing: các đoạn mồi bám vào sợi ADN khuôn tại vị trí khởi đầu để bắt đầu quá trình tổng hợp sợi ADN mới
- Extension/elongation: enzyme Taq polymerase sẽ tham gia hoạt động tổng hợp bằng cách sử dụng các dNTPs để gắn lại với nhau tạo thành chuỗi bổ sung
- Final elongation: sau khi trải qua một vòng lặp các chu trình nhiệt [25-40 vòng tùy theo thí nghiệm], phản ứng PCR tiếp tục được duy trì ở nhiệt độ 70–74 °C trong thời gian 5-10 phút để đảm bảo rằng toàn bộ các sợi ADN đơn sẽ được kéo dài hoàn toàn. Ở thời điểm này, số lượng các bản sao ADN của trình tự ADN ban đầu có thể đạt đến con số 230, or 1073741824 bản sao.
- Final hold: toàn bộ khay phản ứng PCR được làm mát ở nhiệt độ 4–15 °C trong một khoảng thời gian không xác định và có thể được xem như là giai đoạn lưu trữ ngắn hạn các sản phẩm của phản ứng PCR.
Quy trình kỹ thuật PCR thường sử dụng 6 thành phần cơ bản và trải qua 6 bước nêu trên.
Mặc dù vậy, thực tế triển khai không chỉ đơn thuần là lấy mỗi thành phần một ít và trộn đều với nhau trong ống PCR rồi cho vào máy chạy là sẽ có hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu như mong muốn.
Trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, đặc biệt là phòng xét nghiệm ADN, mỗi phản ứng PCR cần được tối ưu hóa theo các tiêu chí của công việc để có thể nhân bản được đúng trình tự ADN mong muốn với độ tin cậy cao.
>>> Xem thêm: PCR – 6 thành phần quan trọng cần hiểu cho đúng
Kỹ thuật PCR và ứng dụng
Trong quãng thời gian hơn 30 năm kể từ khi PCR được sử dụng lần đầu tiên, kỹ thuật này đã tác động mạnh mẽ đến mọi lĩnh vực chuyên ngành liên quan đến Khoa học sự sống và Y Sinh học.
Kỹ thuật PCR đã giúp làm thay đổi cách thức nghiên cứu và nâng cao năng suất làm việc của các chuyên ngành từ pháp y, an toàn thực phẩm, chẩn đoán lâm sàng cho đến nghiên cứu hệ gen [genomics].
Trên thực tế, kỹ thuật PCR đã trở nên phổ biến, đôi khi hơn cả sự tưởng tượng mà chúng ta có thể nghĩ ra. Thuật ngữ “PCR” cũng đã là một từ trong Từ điển đại học Merriam-Webster.
Trong lĩnh vực xét nghiệm ADN, kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân bản các đoạn ADN tách ra từ đứa trẻ và người cha nghi vấn. Ở bước tiếp theo, sản phẩm PCR sẽ được dùng để phân tích trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới.
Tài liệu tham khảo
TS. Đặng Trần Hoàng
Viện trưởng Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền
DNA polymerase là một nhóm enzyme đặc biệt có liên quan đến sự sao chép DNA của các sinh vật sống. Thông tin di truyền được truyền từ thế hệ này sang thế hệ tiếp theo do sự hiện diện của enzyme này. Có nhiều dạng khác nhau của enzyme DNA polymerase được tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ. DNA polymerase 1, 2 và 3 chỉ được tìm thấy ở các sinh vật nhân sơ và chúng đóng vai trò khác nhau trong quá trình sao chép DNA. Sự khác biệt chính giữa DNA polymerase 1 2 và 3 chủ yếu dựa vào chức năng chính của mỗi enzyme. DNA polymerase 3 là enzyme chính xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA, trong khi DNA polymerase 1 và 2 tham gia vào quá trình sửa chữa và hiệu đính DNA.
NỘI DUNG1. Tổng quan và sự khác biệt chính2. DNA polymerase là gì3. DNA polymerase 1 là gì4. DNA polymerase 2 là gì5. DNA polymerase 3 là gì6. So sánh cạnh nhau - DNA polymerase 1 vs 2 vs 3
7. Tóm tắt
DNA polymerase là gì?
Sao chép DNA là bắt buộc để truyền thông tin di truyền từ cha mẹ sang con cái. Điều này được tạo điều kiện bởi một enzyme đặc biệt gọi là DNA polymerase. DNA polymerase có thể được định nghĩa là một loại enzyme có mặt khắp nơi, xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA bổ sung cho DNA hiện có trong các tế bào sống. Nó lần đầu tiên được phát hiện trong E coli bởi Arthur Kornberg vào năm 1955. Sự sao chép và bảo trì DNA chủ yếu được chi phối bởi các polymerase DNA trong tế bào. Khám phá về DNA polymerase đã giúp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử. Đây là enzyme cần thiết để tổng hợp các chuỗi DNA mới tương tự DNA ban đầu của các sinh vật từ nucleotide trong nhiều kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm PCR, nhân bản gen, giải trình tự gen, chẩn đoán bệnh, liệu pháp gen, phân tích đa hình, v.v..
DNA polymerase tồn tại ở nhiều dạng khác nhau từ hình dạng và kích thước. Họ thuộc một số gia đình: A, B, C, D, X, Y và RT. Các polymerase DNA prokaryotic được nhóm thành năm loại khác nhau, đó là DNA polymerase 1, DNA polymerase 2, DNA polymerase 3, DNA polymerase 4 và DNA polymerase 5. Các sinh vật nhân chuẩn có khoảng mười lăm polymerase DNA khác nhau là polymerase β, λ, σ,, α , δ,,, ι,, Rev1, ζ, γ, và ν.
Hình 01: DNA polymerase
Khi tổng hợp DNA mới bằng DNA polymerase, nó bắt đầu từ đầu 3 'và hướng tổng hợp về phía đầu 5 by bằng cách thêm nucleotide tại một thời điểm, bổ sung cho DNA mẫu. DNA polymerase cần một nhóm 3 'OH có sẵn để bắt đầu tổng hợp chuỗi và được tạo điều kiện bởi đoạn DNA hoặc RNA nhỏ gọi là mồi. DNA polymerase đọc DNA mẫu và di chuyển từ đầu 3 'đến đầu 5', tạo ra chuỗi DNA 5'-3 'mới.
DNA polymerase 1 là gì?
DNA polymerase 1 [Pol 1] là một enzyme được tìm thấy trong prokaryote giúp sao chép DNA của vi khuẩn. Đây là loại DNA polymerase đầu tiên được phát hiện bởi Arthur Kornberg vào năm 1956. Enzim này có mặt trong tất cả các sinh vật prokaryote. Pol 1 được mã hóa bởi gen pol và bao gồm 928 axit amin. Nó có hoạt động exonuclease 5 'đến 3'; do đó, nó phổ biến như một enzyme sửa chữa DNA hơn là enzyme sao chép DNA. Nó cũng có khả năng xúc tác cho nhiều phản ứng trùng hợp trước khi phát hành DNA mẫu và kết nối các đoạn Okazaki lại với nhau bằng cách lấp đầy DNA mới và loại bỏ các đoạn mồi RNA.
Pol 1 phân lập từ E coli đã được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng phân tử. Tuy nhiên, một khi Taq polymerase được phát hiện, nó đã thay thế E Coli Pol 1 trong công nghệ PCR. Taq polymerase là một loại DNA polymerase ổn định nhiệt thuộc Pol 1.
Hình 02: DNA polymerase 1
DNA polymerase 2 là gì?
DNA polymerase 2 [Pol 2] là một enzyme prokaryotic xúc tác sự sao chép DNA. Nó thuộc họ polymerase B và được mã hóa bởi gen polB. Nó lần đầu tiên được phát hiện từ E coli bởi Thomas Kornberg vào năm 1970. Pol 2 là một protein hình cầu bao gồm 783 axit amin. Nó có cả hoạt động exonuclease 3 'đến 5' và hoạt động polymerase 5 'đến 3'. Nó tương tác với các enzyme DNA polymerase 3 để duy trì độ trung thực và quá trình sao chép DNA. Pol 2 cũng có khả năng đọc lại DNA mới được tổng hợp cho chính xác.
Hình 03: DNA polymerase 2
DNA polymerase 3 là gì?
DNA polymerase 3 [Pol 3] là enzyme chính xúc tác cho sự sao chép DNA ở sinh vật nhân sơ. Nó thuộc họ C polymerase và được mã hóa bởi gen polC. Nó được Thomas Kornberg phát hiện vào năm 1970. Pol 3 là một thành phần của quá trình sao chép và có thể thêm 1000 nucleotide mỗi giây vào chuỗi DNA mới trùng hợp.
Pol 3 là một holoenzyme bao gồm mười protein riêng biệt và có ba phân tử chức năng là α, và. Ba phân tử chức năng của Pol 3 chịu trách nhiệm riêng cho ba hành động của enzyme. Tiểu đơn vị α quản lý quá trình trùng hợp DNA trong khi quản lý hoạt động đọc lại exonuclease của enzyme pol 3. Tiểu đơn vị help giúp tiểu đơn vị for đọc lại.
Hình 04: Tiểu đơn vị DNA polymerase 3
Sự khác biệt giữa DNA polymerase 1 và 2 và 3 là gì?
| Polyme 1 | Polymerase 1 bao gồm 928 axit amin. |
| Polyme 2 | Polymerase 2 bao gồm 783 axit amin. |
| Polyme 3 | Polymerase 3 là một holoenzyme bao gồm mười protein được sắp xếp thành ba tiểu đơn vị chức năng. |
| gia đình | |
| Polyme 1 | Polyme 1 thuộc họ polymerase A. |
| Polyme 2 | Polyme 2 thuộc họ polymerase B. |
| Polyme 3 | Polyme 3 thuộc họ polymerase C. |
| Chức năng chính | |
| Polyme 1 | Điều này chịu trách nhiệm sửa chữa DNA và loại bỏ các đoạn mồi RNA. |
| Polyme 2 | Điều này chịu trách nhiệm về hiệu đính, độ trung thực và quy trình của DNA mới được hình thành |
| Polyme 3 | Điều này chịu trách nhiệm cho phản ứng trùng hợp DNA |
Tóm tắt - DNA polymerase 1 vs 2 vs 3
DNA polymerase là một lớp enzyme quan trọng được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống. Chức năng chính của DNA polymerase là sao chép DNA. Nó có khả năng lắp ráp các nucleotide và tổng hợp DNA bổ sung mới cho DNA hiện có. Enzyme này tồn tại ở các dạng khác nhau khác nhau từ hình dạng và kích thước. DNA polymerase 1, 2 và 3 là các polymerase DNA prokaryote liên quan đến sự sao chép DNA. Pol 1 xúc tác cho việc sửa chữa các thiệt hại DNA. Pol 2 xúc tác cho độ trung thực và quá trình sao chép DNA. Pol 3 xúc tác cho phản ứng trùng hợp DNA 5 'đến 3'.
Tài liệu tham khảo:1. Lehman, I. R. ăn khám phá DNA polymerase. Tạp chí Hóa học sinh học. N.p., ngày 12 tháng 9 năm 2003. Web. Ngày 06 tháng 3 năm 20172.Gardner, Andrew F. và Zvi Kelman. DNA polymerase trong công nghệ sinh học. Biên giới. Biên giới, ngày 13 tháng 11 năm 2014. Web. Ngày 06 tháng 3 năm 2017
3. Garcia-Diaz, Miguel và Katarzyna Bebenek. Nhiều chức năng của DNA polymerase. Đánh giá quan trọng trong khoa học thực vật. Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, tháng 3 năm 2007 Web. Ngày 06 tháng 3 năm 2017
Hình ảnh lịch sự:1. DNA DNAasease Di Diikikzuul - Opera propria [CC BY-SA 3.0] qua Commons Wikimedia2. Quảng cáo polymeraseDomains miền By [chưa rõ] phân tử của tháng, tháng 3 năm 2000 - Ngân hàng dữ liệu protein [miền công cộng] thông qua Commons Wikimedia3. Cấu trúc Pol2 [Dựa trên 35KM] Trực tiếp bởi Sbandeka - Công việc riêng [CC BY-SA 4.0] qua Commons Wikimedia
4. DNA DNA polymerase III [có tiểu đơn vị] Trực tiếp Alepopoli - Công việc riêng [CC BY-SA 3.0] qua Commons Wikimedia