Tại sao nồng độ ADN được xét theo a260 a280

Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcSau khi thu được kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến độ tinhsạch của DNA tách chiết. Nồng độ NaCl thích hợp đã được xác định, từ đó giúp giảiđáp vấn đề quan trọng trong thu tách DNA- độ tinh sạch.Khảo sát tiếp theo được thực hiện với mục tiêu quan tâm chính là lượng DNAthu tách được. Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm tìm ra tỷ lệ thích hợp giữa hạt sắttừ với lượng mẫu cần thu tách DNA đầu vào.Các lượng hạt sắt từ khác nhau đượcdùng trong các thí nghiệm khảo sát này: 1mg; 1,5mg; 2mg; 2,5mg và 3mg.Yếu tố pH, thời gian ủ và nồng độ NaCl được giữ cố định lần lượt ở pH = 8 và15 phút và 3M.Mật độ tế bào vi khuẩn dùng trong khảo sát này đạt 109 tế bào/ml. Qua khảosát, việc tăng lượng hạt nano sắt từ sử dụng kéo theo sự tăng lượng DNA thu được,với giá trị A260 tăng từ 0,47 lên 0,55. Tại hai mức khảo sát là 2,5mg và 3 mg hạtsắt từ thì lượng DNA thu được là lớn nhất và không đổi.Hình 3.7: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi thu tách với các lượng hạt sắttừ khác nhau.Hình 3.8: Kết quả điện di các mẫu DNA tách bằng các lượng hạt nano sắt từkhác nhau.a,b,c,d và e : lần lượt là mẫu sử dụng các lượng hạ sắt từ 0,5mg; 1mg; 1,5mg; 2mg;2,5mg và 3mg.Trang 35Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcTheo hình 3.8, các băng DNA điện di có bề dày tăng dần từ mẫu a đến mẫu e.Điều này cho thấy lượng DNA thu được tăng dần với sự tăng lượng hạt sử dụng.Kết quả này phù hợp với giá trị độ hấp thụ quang mà các mẫu khi ở bước sóngA260.Với kết quả thu được, có thể ước lượng tương đối lượng hạt nano sắt từ cần sửdụng để thu tách tối đa lượng DNA từ mẫu vi khuẩn có mật độ 10 9 tế bào/ml là 2,53 mg cho 1,5ml dịch nuôi cấy.3.2.5.Kết quả khảo sát các nồng độ ethanol trong quá trình rửa hạt sắt từPhức hệ DNA và hạt nano sắt từ sau khi thu tách cần được xử lý để loại cácion, chất còn bám sót lại. Ethanol với các nồng độ khác nhau được dùng làm chấtloại rửa trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, một vấn đề đặt ra là liệu DNA có bị rửatrôi, trong khi DNA có khả năng tan trong nước. Vì vậy, các thí nghiệm khảo sátnồng độ ethanol dùng trong giai đoạn rửa được tiến hành.Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.9.Hình 3.9: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi rửa tủa ở các nồng độ ethanolkhác nhau.Lượng DNA thu được khi rửa tủa bằng ethanol tuyệt đối cho giá trị A260 caonhất; 0,63. Trong khi, lượng DNA thu được giảm dần khi sử dụng ethanol nồng độthấp làm chất rửa; cụ thể là giá trị A260 của mẫu khi rửa với ethanol 99% vàethanol 70% đạt 0,55; mẫu rửa với ethanol 99% và ethanol 50% đạt 0,51. Trong khiđó, các mẫu đều đạt độ tinh sạch với tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.Trang 36Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcHình 3.10: Kết quả điện di các mẫu DNA rửa với ethanol các nồng độ1,2 và 3 : lần lượt là mẫu rửa với ethanol 50%, 99% và 70%.Kết quả điện đi các mẫu DNA khi rửa giải bởi ethanol các nồng độ cho thấysự khác nhau rõ rệt về lượng DNA thu lượng. Băng DNA số 2, ứng với phươngpháp rửa giải dùng ethanol 99% cho vạch DNA dày nhất. Trong khi đó, lượng DNAở băng số 1 là ít nhất.3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng thu hồi DNATrong các nghiên cứu về thu DNA bằng hạt nano sắt từ khác trên thế giới, saugiai đoạn rửa tủa, DNA được tách khỏi hạt sắt từ qua giai đoạn giải hấp. Trong giaiđoạn này, tủa DNA và hạt sắt từ được hòa trong đệm TE 1X, và lắc đều ở 65oC.Khi thêm đệm TE vào tủa để giải hấp, các phân tử nước sẽ tương tác với cácphân tử DNA bằng liên kết hydro và phá bỏ sự hấp phụ giữa DNA và hạt sắt từ .Nhiệt độ cao giúp đẩy nhanh quá trình giải hấp, tuy nhiên, DNA dễ bị phân hủy ởnhiệt độ cao. Vì vậy, khảo sát tiếp theo này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởngcủa yếu tố nhiệt độ lên chất lượng DNA thu được.Các mức nhiệt độ khảo sát là 25oC, 37 oC và 65 oC. Yếu tố pH, thời gian ủ,nồng độ NaCl và nồng độ ethanol được giữ cố định lần lượt ở pH = 8 ,15 phút , 3Mvà 99 %Trang 37Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcHình 3.11: Số lượng và độ tinh sạch của DNA khi giải hấp ở các nhiệt độkhác nhau.Có sự giảm rõ rệt lượng DNA thu được khi tăng giá trị nhiệt độ giả hấp [hình3.11]. Khi nhiệt độ giải hấp bằng 65 oC, lượng DNA thu được chỉ còn bằng một nửalượng DNA thu được khi giải hấp ở 25 oC. Điều này khẳng định rằng DNA đã bịphân giải nhanh chóng ở nhiệt độ cao.Từ các khảo sát trên, quy trình thu tách DNA từ tế bào vi khuẩn được hoànchỉnh như sau:Với mật độ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis bằng 109 tế bào/ml.+ Hút 1,5 ml mẫu dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. Sau đó, thực hiện ly tâm6000 vòng/phút, trong 10 phút để loại dịch nổi và thu cặn tế bào.+ Kế tiếp, tiến hành ly giải màng tế bào: huyền phù tế bào trong 300µl đệmTE 1X pH = 8; tiếp theo, bổ sung 50 µl dung dịch NaCl 0,5 M và 50 µl dung dịchSDS 10% vào, rồi vorted để trộn đều. Sau đó, ủ dịch ở 65 oC trong 10 phút, rồi ủtrên đá trong 5 phút.+ Cho 500 µl đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ [PEG6000 10% vàNaCl 3M] vào dịch ly giải. Đảo trộn hỗn hợp bằng cách lắc eppendorf xuôi ngượctrong 5 phút. Tiếp đến, để yên eppendorf trong 5 phút.+ Thêm 3mg hạt nano sắt từ vào [ ứng với 242µl huyền phù hạt sắt từ trongnước]. Lắc đều hỗn hợp trong 7 phút, sau đó đảo 10 lần, rồi để yên 8 phút.+ Tiếp theo, dùng nam châm hút lại hệ hạt nano sắt từ và DNA, loại dịch.+ Kế tiếp, rửa tủa 2 lần trong 1ml ethanol 99%, rồi rửa tiếp trong 500 µlethanol 99%, 2 lần. Sau đó loại bỏ phần dịch.+ Giai đoạn tiếp đến, hòa tủa trong 200 µl đệm TE 1X, lắc đều trong 5 phút.+ Sau cùng, thu lấy phần dịch trong chứa DNA và đem đi bảo quản.Trang 38Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcTrang 39Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊKết luận:Với kết quả nghiên cứu này đem lại, các kết luận được rút ra như sau:1. Hoàn chỉnh quy trình tổng hợp hạt sắt từ và tự tổng hợp được sản phẩmmong muốn bằng phương pháp đồng kết tủa với các thông số cụ thể: phản ứng thựchiện trong điều kiện không có oxi, nhiệt độ môi trường tổng hợp 60oC, thành phầntham gia phản ứng gồm 5 ml dung dịch FeSO 4 0,1 M và 5ml dung dịch FeCl3 0,2M , 10 ml NH4OH 0,8M dùng làm chất khử , tốc độ nhỏ giọt 1 giọt/giây. Hạt nanosắt từ sau khi tổng hợp sẽ được rửa hạt bằng nước cất, đến khi pH nước rửa về pHthì dừng rửa. Sản phẩm được lưu trữ trong dung môi là nước đã sục khí trơ.2. Việc thu tách DNA bằng hạt sắt từ tự tổng hợp cũng đã thành công; DNA táchđược đạt yêu cầu tinh sạch. Quy trình thu tách DNA gồm các bước: ly giải màng tếbào, gắn DNA với hạt sắt từ, rửa tủa và giải hấp thu hồi DNA. Thành phần đệmdùng trong giai đoạn gắn gồm PEG 6000 10% và NaCl 3M. Hóa chất dùng rửa tủalà ethanol tuyệt đối. Quá trình giải hấp được thực hiện với đệm TE 1X pH=8.Kiến nghị:Trong quá trình thực hiện nghiên cứu đã xảy ra một vài điểm cần lưu ý và cần cóbiện pháp xử lý.Thứ nhất, về vấn đề kiểm tra lại kích thước hạt nano sắt từ đã được tổng hợp.Các mẫu hạt cần phải được đem đi chụp TEM để xác định độ phân bố kích thướchạt, cũng như từ tính của hạt. Từ kết quả thu được mới có thể khẳng định một cáchchính xác về chất lượng và độ ổn định của hạt nano sắt từ tổng hợp.Thứ hai, về vấn đề bảo quản hạt nano sắt từ sau tổng hợp. Sự có mặt của oxitrong không khí và oxi hòa tan trong dung môi bảo quản là yếu tố gây suy giảm từTrang 40Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng Đứctính của hạt nano sắt từ trong quá trình bảo quản. Vì vậy, đề nghị sục khí argon vàodung dịch bảo quản chứa hạt nano sắt từ, đồng thời, sử dụng dụng cụ chuyên dụngbịt kín miệng dụng cụ chứa hạt nano sắt từ. Mặt khác, nên lưu giữ hạt nano sắt từtrong các dụng cụ có dung tích nhỏ, hạn chế mở dụng cụ chứa.Thứ ba, hiện tượng các hạt nano sắt từ tự kết tụ với nhau do lực tương tác giữacác hạt. Để giải quyết vấn đề này, có hai cách, một là bảo quản hạt nano sắt từ trongcác dung môi có các chất hoạt động bề mặt để phân tán đồng nhất các hạt trongdung môi, hai là phải đồng hóa hạt trong mỗi lần sử dụng. Một hướng khác là baophủ bề mặt hạt nano sắt từ bằng các chất hóa học, từ đó làm các hạt tịch điện cùngdấu, tạo ra lực đẩy giữa các hạt.Thứ tư, về chất lượng DNA thu tách bằng phương pháp sử dụng hạt nano sắttừ. Kết quả điện di thu được cho thấy các băng DNA không mịn, xuất hiện các tia.Điều này có lẽ DNA đã bị đứt gãy. Vì vậy, cần sử dụng thêm các hóa chất bảo vệDNA và biến tính các DNA. Ngoài ra, để chắc chắn DNA thu được không bị đứtgãy sau khi đã sử dụng các biện pháp bảo vệ, cần thực hiện các kỹ thuật kiểm tra sựtoàn vẹn của DNA.Thứ năm, nghiên cứu này chưa thực hiện khảo sát so sánh khả năng tách DNAbằng hạt nano sắt từ với tách DNA bằng phenol-cloroform. Vì vậy nghiên cứu tiếptheo cần thực hiện đồng thời hai phương pháp trên, từ đó có những đánh giá kháchquan.Ngoài sử dụng hạt nano sắt từ trong thu tách DNA, trên thế giới, hạt nano sắt từcòn được xử lý bề mặt bằng một số chất, ví dụ như hạt nano sắt từ có gắn nhómamin[30], hạt nano sắt từ có gắn nhóm cacboxyl [27] . Một số nghiên cứu kháckhảo sát ảnh hưởng của diện tích bề mặt hấp phụ lên khả năng tách DNA thông quaviệc dùng phức hợp cacbone nano tube [31] và hạt nano sắt từ. Do đó, để có đánhgiá toàn diện hơn về phương pháp thu DNA bằng hạt nano sắt từ, cần tiến tổng hợpvà xử lý bề mặt hạt oxit sắt từ với các nhóm–NH 2, - COOH. Sau đó so sánh khảnăng tách DNA của các loại hạt oxit sắt từ : hạt trần, hạt được gắn thêm nhóm chứcbề mặt –NH2 và phức hệ hạt oxit sắt từ - cacbone nano tube.Trang 41Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcMột vấn đề đáng chú ý khác đó là thu tách RNA, protein. RNA, đặc biệt làmiRNA là đối tượng nhận được nhiều sự quan tâm trong các nghiên cứu về việctầm soát và phát hiện ung thư. Một số nghiên cứu đã thực hiện tách mRNA bằng hạtnano sắt từ được gắn nhóm –COOH và đạt thành công[32]. Bên cạnh các ứng dụngthu tách các phân tử sinh học, hạt nano sắt từ được sử dụng làm các chất nền, chấtmạng trong các nghiên cứu về cố định enzyme, dẫn truyền thuốc, tiêu diệt tế bàoung thư, ví dụ như sử dụng protein conora được cố định trên hạt nano từ để xâmnhập vào tế bào ung thư [29]. Do đó, đề nghị định hướng nghiên cứu tiếp theo choứng dụng của hạt nano từ tính trong y sinh.Trang 42Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcTrang 43Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng ĐứcTÀI LIỆU THAM KHẢOA.Tài liệu trong nước:[1] Lê NgọcTú [2002]. Hóa sinh công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, HàNội.[2] Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung . 2007. “Chế tạo và nghiêncứu tính chất từ của các hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong tinh sinh học”. Tạp chíKhoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23. 231-237.[4] PGS.TS Trần Thị Xô, Th.S Nguyễn Thị Lan [2005]. Cơ sở di truyền và côngnghệ gen. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.[5] GS.Phạm Văn Tường [2007]. Vật liệu vô cơ. Nhà xuất bản Đại học quốc gia HàNội. Hà Nội.[6] Th.S Ngô Thái Bích Vân, Bài giảng thí nghiệm cơ sở di truyền và công nghệgen[7] Trần Yến Mi, Dương Hiếu Đẩu và Lê Văn Nhạn [2011] “Khảo sát ảnh hưởngcủa nồng độ tiền chất lên khích thước và từ tính hạt nano oxid sắt”. Tạp chí Khoahọc 20b, Đại học Cần Thơ. 272-280.B.Tài liệu nước ngoài:[8] A. Bandyopadhyay, S. Chatterjee and K. Sarkar. 2011. “Rapid isolation ofgenomic DNA fromE. coli XL1 Blue strain approaching bare magneticnanoparticles”. Current science, vol. 101, no. 2[9] Alexiou C, Arnold W, Klein R J, Parak F G, Hulin P, Bergemann C, Erhardt W,Wagenpfeil S and Lubbe A S [2000]. “ Locoregional cancer treatment withmagnetic drug targeting”. Cancer Res. 60 6641–8[10]An-Hui Lu, E. L. Salabas, and Ferdi Schuth [2007]. “ Magnetic Nanoparticles :Synthesis , Protection , Functionalization , and Application”. Angewandte ChemieInt., Vol 46, pp 1222 – 1244Trang 44Đồ án tốt nghiệpLongGVHD: TS. Đặng Đức[11] Enochs W S, Harsh G, Hochberg F and Weissleder R [1999]. “Improveddelineation of human brain tumors on MR images using a long-circulating,superparamagnetic iron oxide agent”. J. Magn. Res. Imag. 9 228–32[12] Hafeli U, Pauer G, Failing S and Tapolsky G [2001]. “Radiolabeling ofmagnetic particles with rhenium-188 for cancer therapy”. J. Magn. Magn. Mater. ,225, 73–8.[13] Hofmann W-K, de Vos S, Komor M, Hoelzer D, Wachsman W and Koeffler HP [2002]. “ Characterization of gene expression of CD34+ cells from normal andmyelodysplastic bone marrow” .Blood 100 3553–60[14] Liberti P A, Rao C G and Terstappen [2001]. “Optimization of ferrofluids andprotocols for the enrichment of breast tumor cells in blood”. J. Magn. Magn. Mater,225[15] Lubbe A S, Bergemann C, Riess H, Schriever F, Reichardt P, Possinger K,Matthias M, Doerken B, Herrmann F and Guertler R [1996]. “Clinical experienceswith magnetic drug targeting: a phase I study with 4-epidoxorubicin in 14 patientswith advanced solid tumors”. Cancer Res, 56 4686–93.[16] Mah C, Fraites T J, Zolotukhin I, Song S, Flotte T R, Dobson J, Batich C andByrne B J [2002]. “ Improved method of recombinant AAV2 delivery for systemictargeted gene therapy” Mol. Therapy 6, 106–12[17] Martina Pilloni et al. 2010. “PEGylation and preliminary biocompatibityevaluation of magnetic-silica nanocomposites obtained by high energy ballmilling”. International Journal of Pharmaceutics , 103-112.[18]M. Mohapatra and S. Anand [2010]. “Synthesis and applications of nanostructured iron oxides/hydroxides– a review”. International Journal of Engineering,Science and Technology, Vol. 2, No. 8, pp. 127-146[19]Jin Xie .2003. “Synthesis, Modification, and Bioapplications of MagneticNanoparticles”, Nanjing University.[20] Paul F, Melville D, Roath S and Warhurst D [1981]. “A bench top magneticTrang 45