Phương pháp nhuộm hematoxylin eosin là gì

Harris’s Haematoxylin Được dùng để nhuộm nhân tế bào. Được sử dụng trong bộ nhuộm Papanicolaou. Kỹ thuật nhuộm PAP được sử dụng để phân biệt các tế bào trong các sản phẩm phết lam (Cổ tử cung, FNA, đờm, khối u, dịch tiết cơ thể,…) đặc biệt là được sử dụng để kiểm tra ung thu cổ tử cung ở phụ khoa, bộ nhuộm PAP sẽ tạo ra màu đặc trưng cho từng loại tế bào đó.

Hematoxylin – Eosin bộ nhuộm (H&E) là phương pháp nhuộm mô học thường quy phổ biến nhất hiện nay. Định nghĩa một cách đơn giản, H&E là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp, hematoxylin có khả năng nhuộm các thành phần về nhân tế bào, trong khi eosin nhuộm các thành phần của bào tương.

Nhuộm H&E không phù hợp để chẩn đoán tất cả các loại bệnh. Trong một số trường hợp, các kỹ thuật nhuộm thay thế hoặc các phương pháp chẩn đoán khác có thể được yêu cầu để chẩn đoán chính xác một tình trạng cụ thể. 1. Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20- 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ. Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

Các phần mô nứt liên quan đến quá trình xử lý mô kém. Có thể dễ dàng nhận thấy một dấu hiệu khác về các mô được xử lý quá mức khi nhìn vào các tế bào hồng cầu (RBC) trong mạch.

Nước thường được sử dụng làm chất phân biệt eosin vì nó có thể loại bỏ eosin thừa ra khỏi tiêu bản. Cồn khử nước và cồn 100% đầu tiên có thể chứa đủ nước để làm nhạt eosin và phân biệt rõ hơn eosin. Quá nhiều bước sẽ làm màu của eosin nhạt hơn và làm mờ cấu trúc tế bào chất.

Trong khi nhuộm, nước có thể thấm vào rượu (theo eosin) do sự chuyển màu giữa các bước. Khi thuốc thử không được thay thường xuyên, hàm lượng nước sẽ tiếp tục tăng và sẽ được chuyển sang các xylen tiếp theo trước khi phủ lên. Lượng nước thừa trong xylen này theo thời gian có thể gây ra hiện tượng eosin thấm ra khỏi mô. Nó được nhìn thấy trên tiêu bản như hình dưới đây. Hiện tượng này có thể xảy ra ngay cả khi xylene không bị nhiễm nước.

Hình 5. Nước ở khu vực này đã loại bỏ gần như toàn bộ chất cản quang của tế bào chất.

Tùy thuộc vào vị trí, chất lượng nước có thể khá khác nhau. Fluor hóa, độ pH hoặc các khoáng chất khác có thể ảnh hưởng không chỉ đến cách mô tiếp nhận thuốc nhuộm mà còn ảnh hưởng đến tuổi thọ của thuốc nhuộm. Ví dụ, vì hematoxylin có tính axit nhẹ nên nước có độ pH cơ bản có thể làm tăng độ pH của hematoxylin, khiến nó kém hiệu quả hơn. Nếu chất lượng nước kém hoặc thay đổi thì việc sử dụng nước khử ion (DI) là một lựa chọn tốt nhất. Chỉ cần nhớ đảm bảo áp lực nước DI đủ cho thuốc nhuộm.

Mô đông lạnh có thể là mẫu rất khó nhuộm. Thời gian rất quan trọng nên việc rút ngắn thời gian nhuộm màu cho phép nhà nghiên cứu bệnh học phản hồi nhanh chóng với nhân viên phẫu thuật.

Tuy nhiên, một trong những vấn đề lớn nhất là sự nhuộm màu không đồng đều, không liên quan đến việc cắt mô đông lạnh. Nguyên nhân đầu tiên có thể kể đến ở quy trình cố định mô và rửa tiêu bản trước khi nhuộm. Hãy nhớ rằng môi trường được sử dụng để hỗ trợ các mô đông lạnh trong quá trình cắt có thể hòa tan trong nước và PHẢI được loại bỏ khỏi mẫu, không khác gì loại bỏ parafin khỏi các mẫu thông thường trước khi nhuộm. Chất này thậm chí có thể ngăn chặn sự xâm nhập của thuốc nhuộm giống như sáp parafin. Và, không giống như sáp, bạn có thể sẽ không thấy bất kỳ vết nào còn sót lại nào trên tiêu bản khi kết thúc quá trình nhuộm, bởi vì nó đã bị loại bỏ trong quá trình nhuộm.

Hình 6. Sự nhuộm màu không đồng đều vì parafin còn sót lại trên mô.

Các mẫu thường không được nhân viên phòng thí nghiệm thu thập, vì vậy việc đào tạo nhân viên lấy mẫu là điều cần thiết. Thu thập mẫu bằng cách sử dụng miếng gạc, dụng cụ có đầu bông hoặc các thiết bị trung gian khác có thể làm khô mẫu. Hiện tượng này thường thấy nhất khi sinh thiết, đặc biệt khi nhiều mẫu được thu thập từ cùng một bệnh nhân bằng cùng một thiết bị thu thập. Đối với những trường hợp này, việc rửa thiết bị thu thập bằng formalin có thể gây hại cho bệnh nhân, nên sử dụng vật liệu không xốp để lấy mô ra khỏi thiết bị. Nước muối cũng có thể được sử dụng để rửa mô từ thiết bị sang vật chứa khác vì nó sẽ không làm mất nước khỏi mẫu đã thu thập.

Hình 7. Các mẫu được đặt trực tiếp lên gạc không thấm formalin

Mẫu phải được thu thập và ngay lập tức được ngấm vào chất cố định để đảm bảo sự cố định thích hợp. Formalin là chất cố định được sử dụng phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, formalin phải được xử lý như bất kỳ thuốc thử nào khác, đặc biệt là về ngày bảo quản và hết hạn. Để formalin dưới ánh nắng trực tiếp có thể làm thay đổi độ pH của dung dịch, gây ra môi trường axit cho các mô. Tính axit trong chất cố định có xu hướng có hai tác động chính lên mô:

1. Làm khô các cạnh bên ngoài của các mô
2. Làm khô mô quá mức
   Hình 8. Sự xuất hiện của các hạt nuclei có thể cản trở việc chẩn đoán.

Khi bộ xử lý mô phát triển, kỹ thuật xử lý của chúng ta cũng phát triển. Từ đó, thời gian của quy trình xử lý ngày càng được sắp xếp hợp lý hơn để đáp ứng nhu cầu của bệnh nhân bằng cách tạo ra hiệu quả trong quá trình xử lý. Vì lý do này, việc đặt tất cả các mẫu lại với nhau trên cùng một giao thức là không còn hợp lý nữa. Các mẫu nhỏ được đặt qua quy trình qua đêm sẽ bị mất nước quá mức, khiến việc phân chia trở nên khó khăn. Ngâm có thể giúp ích, nhưng thường sẽ khiến mô bị nứt. Các mẫu lớn được đặt theo quy trình thích hợp hơn cho sinh thiết sẽ bị khử nước và khó có thể được cắt ra cho đến khi hoàn tất quá trình xử lý thích hợp.

Hình 9. Hình ảnh cho thấy sự nén của các mô được xử lý. Tiêu bản bên phải bị hỏng và các chi tiết của tế bào mỡ kém chất lượng, cho thấy mẫu không được thấm đúng cách

Bong bóng hạt nhân xảy ra khi các protein trong nhân đông lại. Hiện tượng này thường là kết quả của các mẫu được cố định kém và gặp phải nhiệt độ cao. Chất cố định có độ pH cao cũng có thể gây ra hiện tượng này. Môi trường khắc nghiệt khiến protein đông tụ xung quanh những giọt chất lỏng nhỏ, khiến chúng có hình dạng bong bóng.

Nhuộm hai màu Hematoxyline để làm gì?

Nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E) là phương pháp nhuộm chẩn đoán cơ bản trong thực hành giải phẫu bệnh. Phương pháp nhuộm H&E cho phép đánh giá mối liên quan tổng thể giữa các tế bào, những thành phẩn cấu trúc cơ bản của biểu mô, mô liên kết, thần kinh và mô cơ.

Thuốc nhuộm Hematoxylin là gì?

Hematoxylin (viết tắt là H) làm nhân tế bào nhuộm màu xanh hoặc xanh tím, còn eosin (viết tắt là E) nhuộm thành phần ngoại bào thành màu hồng, trong đó các cấu trúc khác có bản chất hoá học khác nhau sẽ cho các sắc màu khác nhau. Kĩ thuật nhuộm này được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1876 nhờ A. Wissowzsky.

Thuốc nhuộm eosin là gì?

Eosin 1% Là hóa chất nhuộm các cấu trúc siêu vi của mô và tế bào, giúp hiển thị protein, mô liên kết, các sợi và keratin trong mẫu sinh học có nguồn gốc từ người. Phụ thuộc vào yêu cầu của người dùng và thói quen cá nhân mà Eosin Y có thể được pha trong nước hoặc trong cồn.

Eosin màu gì?

Nhân là Hematoxylin và có màu tím, tế bào chất là Eosin và có màu đỏ, hồng cầu là Eosin có màu đỏ tươi, tùy từng chất mà ngay cả khi nhuộm cùng một dung dịch nhưng vẫn đưa ra sự biến đổi màu sắc khác nhau.