Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri
Nguyễn Văn Minh82Hình 26: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp màng lọc. Show
2. Đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa.a. Nguyên tắc:Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa petri mơi trường thích hợp.Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy vì mỗi khuẩn là kết quả phát triển của một tế bào.Dùng bút lông kim ghi lên đáy hộp môi trường: tên mẫu, tên người thực hiện, ngày cấy, thể tích dịch cấy, nồng độ pha lỗng.Cách 1 : Dùng pipette vơ khuẩn hút dịch pha loãng cho vào 3đĩa petri môi trường, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Lấy que gạt dàn đều mẫu lên mặt thạch để tách riêng từngtế bào.Cách 2 : Dùng pipette vơ khuẩn hút Vml dịch pha lỗng cho vào3 đĩa petri vơ khuẩn, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Môi trường pha sẵn trong bình 250ml, bảo quản lạnh.Nguyễn Văn Minh83Đun cách thủy môi trường cho tan đều, chờ nguội 40oC, đổ vào các đĩa chứa mẫu, mỗi đĩa 10 - 15 ml mơi trường. Xoay tròn đĩatheo chiều kim đồng hồ và ngược lại cho môi trường hòa đều mẫu, để n cho mơi trường đặc hoàn toàn.Ở 2 cách trên, mỗi mẫu đều cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri, sau đó lấy kết quả trung bình.Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, nuôi ở tovà thời gian thích hợp.Dùng bút lông kim và thước, kẻ các ô vuông ở đáy hộp, cạnh ô vuông từ 10 – 15 mm. Đếm số khuẩn lạc trong các ô vuông theolần lượt theo hình zic zắc....1 1i ivd nvd nC mlghayCFU CFUN ++ =∑N: Số tế bào đơn vị hình thành khuẩn vi khuẩn trong 1 g hay 1ml mẫu.Σ C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn.n1: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ 1.di: Hệ số pha lỗng thứ i.v: thể tích dịch mẫuml cấy vào mỗi đĩa petri.Ø Nguyên tắc: Phương pháp MPN phương pháp có số xác suất cao nhất ; số tối khả còn được gọi là phương pháp pha lỗng tới hạnhay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớnnhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thínghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. ThôngNguyễn Văn Minh84thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau : Cho vào các ống nghiệm có chứa mơi trường thíchhợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ phalỗng bậc 10 liên tiếp ví dụ 110, 1100, 11000. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiển chứng minh sựtăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …, ghinhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mậtđộ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN100ml hay số MPN1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào sốlượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha lỗng. Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ loạivi sinh vật nào bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trường tăng sinh chọn lọc môi trường lỏng.Ø Thao tác: Cụ thể là đếm Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải.- Lấy mẫu. - Pha loãng mẫu, chọn ba độ pha lỗng liên tiếp thích hợp.- Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 1 ống nghiệm môi trường Lactose broth.- Ủ ấm từ 35 – 37oC24 – 48giờ. Cách đọc kết quả, tra bảng MPN theo hướng dẫn trên.Nguyễn Văn Minh85Trong phân tích mẫu, nếu khơng đoán được chất lượng vệ sinh của mẫu, ta có thể tăng số dãy kiểm tra lên tùy ý. Nhưngkhi đọc kết quả, ta chỉ đọc 3 dãy liên tiếp nhau.
Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi khuẩn ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng. Bạn đang xem: Khuẩn lạc Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn. Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc sẽ mang tính đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc chẩn đoán vi khuẩn học. Các nhà nghiên cứu vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc. Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng. Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy 2.1 Dạng mẫu nuôi cấyDạng dịch mẫu chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.Dạng trên bề mặt của môi trường rắn chứa thạch (từ 1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%). 2.2 Dụng cụ cấyQue cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.Que cấy móc: Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.Que cấy vòng: Là que cấy kim loại đầu có vòng tròn, dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.Ống hút thủy tinh: Dùng để chuyển một lượng vi khuẩn cần thiết lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng.Đầu tăm bông vô trùng: Dùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn. 3. Các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
3.1. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petriDùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân lập.Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo.Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm. 3.2. Kỹ thuật cấy trangDùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri.Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Sau đó, để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.Mở đĩa petri, nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt. 3.3. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏngĐốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa rồi hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Dùng ngón út của tay phải để mở nút bông. Sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và làm nguội que cấy (áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội). Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống nghiệm và đậy nút bông rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.Đầu que nuôi cấy vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm. Tiếp đó, đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong. 3.4. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêngPhương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có một số khác biệt sau: Cấy giống lên trên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống.Sau đó, cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch nghiêng. 3.5. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rờiPipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì nó cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri để tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản trong cách nuôi vi khuẩn với pipet đầu rời như sau: Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định đó là: 0,1 ml, 1- 20ml, 20- 20ml, 0,2- 1 ml, 1-5 ml, 1- 10 ml. Nên chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác.Pipet đầu rời có hai nấc: Nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch; nấc 2 (vượt quá nấc 1) dùng để bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống thì cần phải tiến hành trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy.Tay phải cầm pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Sau đó, cắm đầu pipet vào đầu tip.Dùng tay trái giữ ống nghiệm và bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út, áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, sau đó hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống rồi hút lấy dung tích cần thiết. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út tay phải.Đầu tip có chứa vi sinh vật cần được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.Đưa đầu tip vào bên trong môi trường rồi bơm dịch giống vào môi trường. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình và đậy nút bông.Đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer cần phải khử trùng tuyệt đối đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa. Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi nuôi cấy vi khuẩn xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn như: Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ; độ ẩm trong quá trình nuôi ủ cần đảm bảo đủ lượng nước; khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào. Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec là một trong những bệnh viện không những đảm bảo chất lượng chuyên môn với đội ngũ y bác sĩ đầu ngành, hệ thống trang thiết bị công nghệ hiện đại mà còn nổi bật với dịch vụ khám, tư vấn và chữa bệnh toàn diện, chuyên nghiệp; không gian khám chữa bệnh văn minh, lịch sự, an toàn và tiệt trùng tối đa. Xem thêm: Wft Trong Chứng Khoán Là Gì Mới Nhất 2022, Kiến Thức Cơ Bản Để được tư vấn trực tiếp, Quý Khách vui lòng bấm số HOTLINE hoặc đăng ký trực tuyến TẠI ĐÂY. 366.3K Chủ đề: Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri Chẩn đoán vi khuẩn học Cách nuôi vi khuẩn Chỉ định nuôi cấy vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn |